CORD-19:07e34ead4449affe21cf5cf80737f6ad67d59009 JSONTXT 9 Projects

Etablierung eines Fischvirus empfanglichen Zellstammes aus Hypophysen des Karpfens (Cyprinus carpio L.) Establishment of a Fish Virus Susceptible Cell Strain from Pituitary of Carp (Cyprinus carpio L.) Abstract A new continous cell strain (CaPi) was established from normal pitu itary tissue of carp, Cells of a frac tio na ted dispersion (0.25% tryp sin-PBS, 10 "C) of pit uitar ies for med mon olayer (fibroblast-and epithelial-lik e-cells) at 25°C using Eagle's mini mal essentia l medium (M EM) supp lemented with 10% fetal calf serum and non essential amino acids . The continous cell strai n, designated CaPi, was obtained by an enzymati cal selecti on of epitheloid cells fr om the monolayer of the primary pit uitary cell cult ure. T his culture has been subculter ed 70 times over a period of 24 mon ths . CaPi-c ells multiply over a temperature range of 15-35°C wi th an optimum growth temperature of 30°C at a seedi ng density of 1.7 x 10· cells /m\. Chromosome ana lysis ind icate s th e cells are het eroploid and show modal numb ers of 47 chromoso mes. T he CaPi cell line is susceptible to fishviru ses (VHSV, PFR, SVCV) producing cyto pathic effects (CPE). H owever, IPNV repl icate s witho ut visible cell alterations. Es wu rde ein permanenter Z ellstamm (CaPi) aus normalen Hypophysen des Karpfens (Cyprinu s carpio L.) etablierr , Die aus Karpfenh ypoph ysen-Gewe be fra ktioniert frei gesetzten (0.25% T rypsin-PBS-Losung, 10 "C) Zellen bildeten bei 25°C un ter Verwendung von Eagle's M inimal Essent ial Medium (MEM), ange reichert mit 10% fo ta lern Kalberser um und nichtessentiellen Aminosauren eine n Mo nolayer mit fibro blasten-und epithe lahn lichen Z ellen aus. Von dieser Primarkulrur ist der Cal'i-Zellsramrn unter selektiver enzymatischer Abl osung der epithelahnlichen Zellen etab liert worden. Der Zell-Starnm wurde inn erh alb 24 Monaren bisher 70 mal subkul tivie rt. Die CaPi-Zellen verme hre n sich bei Temperaturen zwischen 15-35°C. Die op timale Zellvermehru ng erfolgt bei 30°C unte r Verwendung einer Zelleinsaatm enge von 1,7 x 10' Zellen/ml. Der Modalwert der stetigen Verteilung der Chromosomen betragt 47. Die CaPi-Zeilen vermehren Fischviren mit ausgepragrern zytopathischen Effekt (VHSV, PFR, SVCV), das IPNV repliziert sich ohne wahrnehmbare Zellalterationen. Fischzellkulturen gewinnen fur physiologische, toxikologische und virologische Studien zunehmend an Bedeutung. Unter den in der Literatur zitierten 61 permanenten Fischzellkulturen befinden sich nur 2 vom Karpfen (Cyprinus carpio) abstammende Zell-Linien: a) der aus Flossengewebe hergestellte KGCP-l-Zellstamm, b) der aus neoplastischem Hautgewebe gewonnene EPC-Zellstamm (18) . Wahrend uber die Virusernpfanglichkeit der KGCP-l-Zellen nichts bekannt ist und diese Zell-Linie in der Fischvirologie nicht verwendet wird, finden die EPC-Zellen (6) in vielen Laboratorien sowohl in der Routinediagnostik wie auch in der Forschung haufig Verwendung (3, 4) . Neuere Untersuchungen haben aber gezeigt, daf die in verschiedenen amerikanischen und europaischen Laboratorien gehaltenen EPC-Zellen persistent mit einem Coronavirus infiziert sind (Hertrik, pers. Mitt.), was den weiteren Einsatz dieser Zell-Linie fur virologische Zwecke problematisch machen diirfre. Fur die Erforschung und Diagnostik karpfcnpathogener Viren ist aber das Vorliegen einer vom Wirtsfisch abstammenden Zell-Linie von Bedeutung, zumal beim Karpfen Viren existieren (z.B, das mit den "Karpfenpocken" assoziierte Herpesvirus), die wegen der mutmaRlichen Wirtsspezifitat bisher noch nicht isoliert werden konnten. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, aus Karpfenhypophysenzellen, die prirnar der Untersuchung der Gonadotropinfreisetzung in vitro dienten (16) , einen fur die Fischvirologie geeigneten Zellstamm (CaPi) zu etablieren. Fische Als Zellspender dienten dreisommerige Karpfen (Cyprinus carpio L.), die freundlicherweise vom Fischgesundheitsdienst Bayern e.V. in Grub bei Miinchen zur Verfiigung gestellt worden sind. Die Fische befanden sich in einem guten gesundheitlichen Zustand und hatten ein Durchschnittsgewicht von 1500 ± 500 g. Die Fische wurden mit 1,1,1-Trichlor-2-methyl-2-propanol (Merck) (0,9 gil H20 ) betaubt. Das Ausbluten der Tiere erfolgte durch Abschneiden des ventralen Endbereichs des 4. Kiemenbogens. Nach der Hautdesinfektion mit 70% Isopropanol ist durch aseptische Trepanierung das Gehirn freigeIegt worden, das nach Durchschneiden der Medula oblongata und der kranialen Nerven entfernt worden ist. Die freiliegende Hypophyse wurde mit einem Scharfloffel entnommen und sofort in Minimal Essential Medium (MEM) + Antibiotika (60,ug/ml Gentamicin und 2,5 ,ug/ml Amphotericin B) iibergefuhrt. Der Aufschluf der Hypophysen (16) erfolgte iiber 5 Std. mit 0,25% Trypsin in PBS (Phosphate buffered saline), (pH 7,2) mit Hilfe eines Magnetriihrers bei 4°C. Einzelne stiindlich abgenommene Fraktionen wurden bei 300 g fiir 10 Min. (4 -C) zentrifugiert und das Zellsediment ist mit Anzu ehtsmedium (Eagle's MEM, angereichert mit 10% foralern Kalberserum und nichtessenti ellen Am ino sauren und Antibiotika -Gentamicin 60 pg /ml und Amphotericin B 2,5 pg /ml ) aufgenommen worden. Naeh Bestimmung der Anzahllebenden Zellen (0,5% Trypanbl aulosung, Neubauer-Zahlkammer) wurden die Fraktionen bei 10°C aufbewahrt. Anschliefsend sind die gepoo lten Zellsuspensionen dureh Zugabe eines entsprechenden Volumens Anzuehtsmedium auf 6 X 10 5 Zellen /ml eingestellt worden. Die Anzu eht der Zellen erfolgte in Plastikflaschen mit ein er Wachstumsfliiehe von 25 em' (Falcon 3013) bei 25°C. Innerhalb 7 Tagen waren die Zellen zu einem Monolayer mit gemischten Z ellty p (fibro blastcnahnliche und epitheloide Zellen) ausgewachsen. Durch selek ti ve enzymatisehe Ablosung von epirhelahnl ichen Zellen einer konfluenten prirnaren Karp fenh ypophysen zell kultur (bcstehend aus ep irhel-und fibrobl astenahnlichen Zellen) wurde ein permanenter Zellstamm (CaPi ) gewonnen. Die ep irhelartigen Zellen losten sieh innerhalb von 5 Min. , die fibroblasrenahnlichen d agegen erst naeh ca. 10 Min. ab oDie selektiv abgenommenen, epirhelahnlichen Zellen (CaP i) wurden in PBS aufgenommen, sedimentiert (400 g, 4°C, 10 Min. ) und mit Anzuehtsmedium (5 ml ) neu in Plastik-f1aschen (25 em' -Falcon) eingesar, Die Feststellung der optim alen Zelleinsaatmenge fur CaP i-Ze1len erfolgte unter Einsaat von 1 X 10 5 , 2 X 10 5 , 6 X 10 5 und 1 x 10· Zellen /ml. Die Z ellvermehrung bei 30°C wurde iiber einen Ze itraum von 7 Tagen aile 24 Std. sowie 11 und 14 Tage na ch der Einsaat ermittelt (Zellzahl aus jeweil s 3 Kulturen). CaPi-Ze!len (6 x 10 5 Zell en /ml) wurden bei 5, 10, 15,20, 25, 30, 35 und 37°C inkubiert. Irn 24stiindigen Rh ythmus sind die Zell vermehrungsraten von je 3 Kulturen untersucht worden. Es wurde di e Methode von Aubert (5) und Paul (14) verwendet. Nach Umwandlung der Forme! (N = N oe k t ) crhalt man die Gleichung : log N = log No + kt log 2. Die Chro mosomenana lyse der Karpfenhypophysenzellkultur (1. Subkultur) und CaPi-Zellen (53. Subkultur) wurde naeh der Method e von Scbroy U. T odd (17) Die Haufigkeitsverte ilung der Chromosomen normaler Karpfenhypophysenzellen in Kultur zeigten im Vergleich mit den CaPi-Zellen deutliche Unterschiede (Abb, 4) . Der Modalwert der stet igen Verteilung der Chromosomen der Karpfenhypoph ysenzellen (3. Subkultur) ist 91, der der CaPi-Zellen (53. Subkultur) 47. Die Rhabd oviren (VHS, PFR, SVCV) vermehrten sich in den CaPi-Zellen von der 1. bis zur 5. Passage mit Ausbildung zytopathischer Effekte (CPE) und char akteristischer Plaques. Der SVCV-Titer blieb wahrend 5 Passagen in CaPi-Zellen weitgehend kon stant (6, (2) (3) (4) (5) (6) 8 log KlD 50 /0,1 ml). Das PFR zeigte zwischen der 1. und 2. Passage eine T irererhohung von 6,5 auf 8,2 log KID 50 /0,1 rnl, dan ach erfolgte cine Stabili sierung der Ti ter auf den Ausgangswert (1. Passage). Der Infekt ion stiter des VHS blieb wa hrend der 5 Passagen eben falls weitgehend kon stant (7,2-7,8 log KID 50 /O,1 ml). Das lPN-Virus vermehrt e sich in CaPi-Ze llen (1. Passage) mit bis zu 80% ausgebildetem CPE und einem Titer von 7,2 log KlD 50 /0,1 m!. Ab der 2. Passage betrug die CPE-Ausbildung nur 20% und der Viru stiter sank auf 4,8 log KI0 50 /O,1 ml (Titration in hornologen Zellen ). Ab der 3. Passage blieb der CPE aus, und es konnte bei einer Ti tration mit homologen Z cllen kein Virusgehalt mehr errnittelt werden . Eine Kontroll-T itr ation in PG-Z ellen erga b dagegen einen Virus-Ti ter von 7,2 log KI0 50 /O,1 ml, was auf eine nichtzytolytische Virusreplikat ion in Ca Pi-Ze lIen schlie-Ben lafSt (Tab. 1). In der vorliegenden Arbe it wird die Etablieru ng eines permanenten Zellstammes (CaPi-Zellen) aus Karpfenhypophysen beschrieben. Aus der Literatu r sind bis jetzt nur zwei vom Fisch abstammende Hypophysenzellkulruren bekannt: Eine von Buntb arschen (15) zum Zwecke morph ologischer Untersuchungen erabliert und eine von Regenbogenforc1len (11) fur morphologische und virolo gische Studien hergesrellt. Der Z ellstamm (CaPi) unterscheidet sich hin sichtl ich der Morpho logic, Chro mosomena nza hl sow ie irn Wac hstu msverha lten von den urspr iinglichen prirnaren H ypoph ysenzellen. Wii-hrend die prirnar cn Karp fenhypoph ysenzellen aus verschiedenen Ze lltypen bestanden , sind die CaPi-Z ellen rein epitheloid. Weiterhin wurde bei den Karp fenh ypophyscnzellcn (3. Subkultur) ein Mo da lwer t von 91, bei den CaPi-Ze llen (53 Subkultur) von 47 hin sichtlich der stetigen Vertei lung der Chro mosomen errnitrelt. Die Ursache der abweichenden Chromoso mena nzahlen des Ausgangsmaterials (2n = 104) (7) und der in vit ro kulti viert en Ze llen ko nnte in der vorliegenden Arbeit nicht geklart werden . Bei fast allen untersuchten Z ell-Linien wurde cine vom Ausgangsrnat crial abw eichcnde Chrornosornena nza hl errnittelt. In der Regel vcrfiigen Zell-Lini en uber triploide bis tet raploid e Chro moso mena nzahlen, allerdings wurden bei einigen Zcll-Linien auch subdiploide Kar yot ypen festgestellt (zitiert nach 12). Im Gegensatz zu den primaren Karp fenh ypophysenzellen zeigen die CaPi-Z ellen keine Gona dotropinfreisetzung in vitro (16) und weisen stellenweise ein rnehrschichtiges Wachstum auf. Augerd em wurde festgestelIt, dag cine dichte Karpfenhypophysenzellkultur ca. 43% weniger Zellen enthalt als eine dichtgewachsene CaPi-Zellkultur . Sowohl fur die Vermehrung prirn ar er Karpfenhypophyscnzellcn als auch fur die der CaPi-Z ellen wurde die gleiche optimale Temperatur von 30°C errnittelt. Die CaPi-Z ellen liefsen sich bei 15°C ohne Mediumwechsel iiber 2 M on at e in einem guten subku ltivierba ren Zu stand halten, Mit Ausnahm e des lP N-Virus vermehrten sich die unt ersuchten Viren (VHS, PFR, SVCV) in den CaPi-Zellen unt er Ausbildung zytopathischer Effekte. Mi t 100 infekt iosen Einheiten des IPN-Virus infizierte Z ellen zeigren einen bis zu 80% ausgebildeten CPE, der in der 2. Passage nur noch 20% betru g und eine T iterabn ahme von 7,2 au f 4, 8 log KID so aufwies. Bei der 3. Passage wurde kein CPE mehr beobachtet und es konnre auch mit den hom ologen Zellen kein Virus mehr nachgewiesen werden. Unter Verwendung von PG-Z ellen (1) wurde dagegen dennoch eine IPN-Virusrcplik ation bei der 3. CaPi-Passage festgestellt . Ahnliche Beobachtungen haben Nicholson et al. (13) bei Infektionsstudi en von 4 Fischzell-Linien mit verschiedenen IPNV-Isolaten gernacht, Aus der Literatur ist weiterhin bekannt, daB FH M-Zellen, die aufgrun d ihrer Morphologic den CaPi-Z elien ahnlich sind, nichtzytolytische IPNV-Replikationen aufweisen (9, 2, 3) . Wie die vorliegenden Unter suchungen zeigen, eignen sich die CaPi-Z elien fur die in vitro-Verrnehrung von Fischviren; insbeso ndere fur da s VHSV, PFR und SVCV. Die vergleichend in der Rou tin ediagnostik eingesetzten FHM (8)-und EPC (6)-Zellen wa ren den CaPi-Z elien hinsichtlich der Sensitivitar und der Virusa usbeute nicht iiberlegen, Fur die Isolierung karpf cnp athogener Viren mit hoher Wirtszellspezifitiit (z.B. Herpesviren) konnten die CaPi-Zelien ein geeignet es Substr at darstellen.