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〈タイトル〉インターロイキン27を産生するCD4陽性T細胞によるマラリア原虫の感染に対する免疫防御の制御 〈著 者〉木村大輔・由井克之 〈著者所属〉長崎大学大学院医歯薬学総合研究科 免疫学分野 〈著者email〉katsu@nagasaki-u.ac.jp（由井克之） 〈対象論文〉 Interleukin-27-producing CD4+ T cells regulate protective immunity during malaria parasite infection. Daisuke Kimura, Mana Miyakoda, Kazumi Kimura, Kiri Honma, Hiromitsu Hara, Hiroki Yoshida, Katsuyuki Yui Immunity, 44, 672-682 (2016) 〈要 約〉 　インターロイキン27はインターロイキン12ファミリーに属する二量体のサイトカインであり，マクロファージや樹状細胞などの自然免疫系の細胞により産生されると考えられていた．筆者らは，マラリア原虫に感染したマウスにおいて，T細胞受容体への刺激によりインターロイキン27を産生し，インターロイキン27に依存的にほかのT細胞によるインターロイキン2の産生や増殖を抑制するCD4陽性T細胞を見い出した．このインターロイキン27を産生する細胞はマラリア原虫の感染において特異的であり，インターロイキン10を産生するTr1細胞やインターフェロンγを産生するTh1細胞とは異なるサブセットであったことから，Tr27細胞と命名した．T細胞に特異的なインターロイキン27ノックアウトマウスにおいてマラリア原虫の感染に特異的なインターロイキン2の産生は抑制されず，増殖およびインターフェロンγの産生も改善され，マラリア原虫の排除が促進された．この研究においては，ユニークなCD4陽性T細胞の存在が明らかにされ，マラリア原虫の感染に対する免疫防御の制御における重要な役割が解明された． はじめに 　インターロイキン12ファミリーのサイトカインとして，インターロイキン12，インターロイキン23，インターロイキン27，インターロイキン35が知られている1)．このファミリーはα鎖とβ鎖の二量体からなるユニークなサイトカインである．インターロイキン12はp35とp40，インターロイキン23はp19とp40が共有結合により強固に結合した二量体で，マクロファージや樹状細胞などの自然免疫系の細胞により産生され，抗原刺激をうけたCD4陽性T細胞のTh1細胞やTh17細胞への分化を誘導することがよく知られている．インターロイキン27はp28とEBI3が非共有結合により結合した二量体として同定され，当初は，Th1細胞への分化を促進するとされたが，そののち，T細胞によるインターロイキン2の産生の抑制，Th17細胞への分化の抑制，インターロイキン10を産生する細胞への分化の促進など免疫抑制能がつぎつぎと報告され，最近では，抑制性のサイトカインとして理解されている2)．インターロイキン27もインターロイキン12およびインターロイキン23と同様に自然免疫系の細胞により産生されると考えられてきた．インターロイキン35はp35とEBI3が非共有結合により結合した二量体で，おもにFoxp3陽性の制御性T細胞により産生され免疫抑制能をもつと報告されている1)． 　マラリアは熱帯において毎年2億人以上が感染し50万人近くが死亡する重要な感染症である．しかしながら，ほかの寄生虫による疾患と同様に，いまだ有効なワクチンは開発されていない．さらに，マラリア原虫の感染においては宿主の免疫応答にさまざまな修飾が生じるが，その詳細や機構については意外なほど理解されていない3,4)．マラリアの流行地においては，何年にもわたりくり返しマラリア原虫が感染することをへて感染に対する自然抵抗性が獲得され，マラリア原虫に感染していてもとくに問題なく日常生活がおくれるようになる．一方，このような抵抗性は長続きせず，流行地を離れて完全にマラリア原虫がいない状態になるとこの抵抗性は失われるといわれている．また，マラリアの患者においては免疫応答が抑制されほかの感染症に感染しやすくなることが指摘されているが，その機構についても十分には理解されていない． 1．マラリアにおけるインターロイキン2の産生の抑制 　マラリアのモデルとしてネズミマラリア感染実験系がある．筆者らは，マラリア原虫Plasmodium bergheiを用い，マラリア原虫の感染にともなう免疫の修飾に関する研究を進めてきた．マラリア原虫に感染したマウスのT細胞において抗T細胞受容体抗体やスーパー抗原によりT細胞受容体を刺激すると，感染していないマウスに比べT細胞によるインターフェロンγの産生が高い値を示す．感染にともないマラリア原虫に特異的なTh1細胞の分化が誘導された結果である．しかしながら，インターロイキン2の産生はいちじるしく低下しており，これはマラリアの患者において報告されたのと同様な結果であった5)．そこで，インターロイキン2の産生のみが低下していることに着目した． 　マラリア原虫に感染したマウスのT細胞においてインターロイキン2をコードするmRNAの発現について調べたところ，T細胞受容体への刺激ののち4時間までマラリア原虫に感染していないマウスのT細胞と同様であったが，それ以降は低下し，なんらかの抑制がかかっている可能性が考えられた．そこで，感染マウスのCD4陽性T細胞を非感染マウスのナイーブCD4陽性T細胞と混和して培養したところ，ナイーブCD4陽性T細胞によるインターロイキン2の産生が抑制されたことから，感染マウスのCD4陽性T細胞にはナイーブCD4陽性T細胞によるT細胞受容体への刺激に対するインターロイキン2の産生を抑制する細胞が含まれることが示唆された．さらに，感染マウスに由来するCD4陽性T細胞の培養上清にはナイーブT細胞によるインターロイキン2の産生を抑制する物質が含まれていたことから，この抑制は液性因子に媒介されることが明らかにされた． 2．免疫抑制能をもつCD4陽性T細胞はマラリア原虫の感染において特異的である 　感染などにより活性化されたCD4陽性T細胞はCD11aおよびCD49dを高発現することからナイーブT細胞と区別される6)．そこで，CD11aおよびCD49dの高発現を仮のマーカーとしてマラリア原虫の感染において特異的なCD4陽性T細胞を同定することができる．この方法を用いたところ，マラリア原虫に感染していないマウスにはCD11aおよびCD49dを高発現するCD4陽性T細胞はほとんど存在しなかったが，マラリア原虫に感染したマウスにはCD11aおよびCD49dを高発現する細胞が10％ほど存在し，すでに報告されているように6)，これらの細胞はPD-1やLAG-3を高発現していた．マラリア原虫に特異的にインターフェロンγを産生するCD4陽性T細胞はすべてこの画分に含まれていた．Foxp3陽性の制御性T細胞7) をFoxp3陽性細胞においてヒトCD2を発現するノックインマウスを用いて分離し，これにより，制御性T細胞，マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞，そのほかのCD4陽性T細胞を得た．この3つのサブセットにおけるCD4陽性T細胞の免疫抑制能について調べたところ，制御性T細胞およびマラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞はナイーブCD4陽性T細胞によるインターロイキン2の産生および増殖を抑制した．しかしながら，これら3つのサブセットの細胞とナイーブT細胞を膜で隔てるトランスウェル培養プレートを用いると，マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞のみに免疫抑制能があり，制御性T細胞は液性因子のみでは抑制できなかった．以上により，マラリア原虫に感染したマウスに特異的なCD4陽性T細胞には，液性因子によりナイーブT細胞によるインターロイキン2の産生および増殖を抑制するFoxp3陰性の細胞が存在することが明らかにされた． 3．マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞はインターロイキン27を産生する 　マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞が産生する抑制因子はなんであろうか？　in vitroにおいて抗体によりサイトカインの活性を中和したところ，この抑制因子は抑制性のサイトカインとしてよく知られるインターロイキン10やTGFβに対する抗体では中和されず，これまでに知られている抑制性のサイトカインではないことが示唆された．そこで，抑制能の知られているそのほかのサイトカインとしてインターロイキン27およびインターロイキン35について調べた．その結果，抗インターロイキン27抗体による中和実験により抑制因子の大部分の活性が失われたことから，培養上清の抑制因子はインターロイキン27であることが示唆された．マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞を抗T細胞受容体抗体あるいは原虫の粗抗原により刺激したところ，ELISA法によりp28およびEBI3が検出されたがp35は検出されなかった．このことから，マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞はインターロイキン27を構成するp28およびEBI3を産生することが明らかにされた．インターロイキン27は樹状細胞やマクロファージなどの自然免疫系の細胞により産生されると考えられていたので，T細胞が産生するという発見は予想外であった．また，培養上清から免疫沈降法によりp28あるいはEBI3の一方を除くと，もう一方も大幅に減少したことから，培養上清においてp28とEBI3は結合した状態で存在することも確認された．RT-PCR法により発現量を比較したところ，マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞は同じマウスから分離したマクロファージよりも多かった． 　細胞内サイトカイン染色法により，マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞によるサイトカインの産生を個々の細胞レベルにおいて調べた．その結果，インターロイキン27陽性細胞は約5%，インターフェロンγ陽性細胞は約12%，インターロイキン10陽性細胞は約3％であった．インターロイキン27陽性細胞はインターフェロンγ陽性細胞およびインターロイキン10陽性細胞とはまったく異なる細胞であったが，インターロイキン10陽性細胞の多くはインターフェロンγに対しても陽性であった．すなわち，インターロイキン27産生細胞は，インターフェロンγを産生するTh1細胞ともインターロイキン10を産生するTr1細胞とも異なるサブセットに属することが明らかにされ，この細胞をTr27細胞とよぶことにした．胸腺において分化したCD4陽性T細胞は制御性T細胞およびナイーブT細胞として末梢を循環する．ナイーブCD4陽性T細胞が樹状細胞によりマラリア原虫の抗原の提示をうけると，マラリア原虫に特異的なT細胞が活性化して増殖し機能分化する．その際に，CD4陽性T細胞は機能をもつエフェクター細胞（Th1細胞，Th2細胞，Th17細胞），あるいは，免疫抑制能をもつT細胞（Foxp3陽性の制御性T細胞，Tr1細胞，Tr27細胞）に分化すると考えられた（図1）． 4．EBI3の産生はp28に依存的である 　p28ノックアウトマウスおよびEBI3ノックアウトマウスを用いて，インターロイキン27を構成するp28とEBI3との関係について解析した．その結果，p28ノックアウトマウスにおいてはp28もEBI3も産生されなかったが，EBI3ノックアウトマウスにおいてはELISA法および細胞内サイトカイン染色法によりp28の産生が検出された．このことから，EBI3の産生にp28は必須であるが，p28はEBI3なしでも産生されることが明らかにされた．p28が単独で産生されるのか，あるいは，ほかのパートナータンパク質と結合して産生されるのかは不明である． 5．マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞の免疫抑制能はインターロイキン27に依存的である 　p28ノックアウトマウスおよびEBI3ノックアウトマウスを用いて，マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞の免疫抑制能とインターロイキン27との関係について調べた．その結果，いずれのノックアウトマウスにマラリア原虫を感染させてもCD4陽性T細胞によるインターロイキン2の産生の低下，および，ほかのT細胞によるインターロイキン2の産生の低下および増殖の抑制はみられず，インターロイキン27がマラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞の免疫抑制能を担うことが示された．T細胞の増殖の抑制については，卵白アルブミンに特異的なT細胞受容体のトランスジェニックマウスから得たOT-II細胞を用いin vivoにおいても確認した．すなわち，マウスにOT-II細胞を移入し，マラリア原虫に感染させてから卵白アルブミンにより免疫すると，感染していないマウスと比較してOT-II細胞の増殖はいちじるしく抑制された．しかしながら，この抑制はp28ノックアウトマウスあるいはEBI3ノックアウトマウスにOT-II細胞を移入した場合には観察されなかった． 6．マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞による免疫防御の制御 　インターロイキン27はマクロファージおよび樹状細胞のほか，CD4陽性T細胞により産生されることが明らかにされた．両者の産生するインターロイキン27は免疫防御の制御においてどのようにはたらくのであろうか？　マクロファージや樹状細胞によるインターロイキン27の産生は感染の早期にピークに達するが，マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞はこれと対等かそれ以上のインターロイキン27を産生した．T細胞の産生するインターロイキン27の役割について検証するため，T細胞およびB細胞をもたないRag-2ノックアウトマウスに野生型のCD4陽性T細胞，p28を欠損したCD4陽性T細胞，EBI3を欠損したCD4陽性T細胞をそれぞれ移入した．これらのマウスにおいては，マクロファージおよび樹状細胞はインターロイキン27を産生できるが，T細胞はインターロイキン27を産生できない．これらのマウスにマラリア原虫を感染させたところ，T細胞がインターロイキン27を産生するマウスと比較して，マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞の数が多く，血清におけるインターフェロンγ値が高く，原虫血症は低く，より長く生き延びた．すなわち，マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞はマラリア原虫に感染した際の宿主の免疫防御に対し抑制的に機能することが明らかにされた． おわりに 　インターロイキン27はインターロイキン12やインターロイキン23と同様にマクロファージや樹状細胞などの自然免疫系の細胞により産生されると考えられていた．この研究においては，インターロイキン27がマラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞により産生されること，この細胞はFoxp3陽性の制御性T細胞，インターロイキン10を産生するTr1細胞，インターフェロンγを産生するTh1細胞とは異なる細胞であることが明らかにされ，Tr27細胞と命名された．さらに，このTr27細胞はインターロイキン27に依存的にほかのT細胞によるインターロイキン2の産生および増殖を抑制し，マラリア原虫の感染に対する免疫防御を抑制することが明らかにされた． 　インターロイキン35はおもに制御性T細胞により産生され免疫抑制能をもつとされる．さらに，インターロイキン35の存在のもとCD4陽性T細胞を抗原により刺激すると，インターロイキン35を産生するiTr35細胞の分化が誘導される8)．しかしながら，この研究においては，マラリア原虫に特異的なCD4陽性T細胞においてはp35の産生は認められず，インターロイキン35の産生は確認されなかった．また，マラリア原虫の感染において制御性T細胞やTr1細胞が免疫を抑制することが報告されているが，Tr27細胞はこれらとは明らかに異なる細胞であった．インターロイキン27はCD4陽性T細胞によるインターロイキン10の産生を亢進しTr1細胞への分化を促進することが報告されている．しかしながら，この研究においては，インターロイキン27ノックアウトマウスと野生型マウスのあいだでインターロイキン10の産生についてとくに違いは認められなかった．また，Tr27細胞の産生する抑制因子はインターロイキン10ではなくインターロイキン27が主であった．したがって，Tr27細胞による免疫抑制の機構はインターロイキン10には非依存的であると考えられた． 　今後の課題として，Tr27細胞が安定的なCD4陽性T細胞の機能サブセットとして存在するのかという問題がある．また，Tr27細胞の分化の誘導や維持の機構はたいへん興味深い．ヒトにおいては，結核の患者の胸水からのインターロイキン27を産生するCD4陽性T細胞の検出が報告されている9)．このことは，ヒトの慢性感染症においてもTr27細胞の分化が誘導されることを示唆している．慢性感染症においては，感染防御のための免疫応答と過剰な免疫応答による宿主のダメージとのバランスをとるため，免疫応答のアクセルとブレーキのさじ加減が重要であり，Tr27細胞がそこに一役かっている可能性が考えられる．Tr27細胞が免疫制御においてはたす役割の解明は，免疫関連疾患における新規の治療戦略や次世代ワクチンの開発に結びつくことが期待される． 〈文 献〉 1) Vignali, D. A. & Kuchroo, V. K.: IL-12 family cytokines: immunological playmakers. Nat. Immunol., 13, 722-728 (2012) 2) Yoshida, H. & Hunter, C. A.: The immunobiology of interleukin-27. Annu. Rev. Immunol., 33, 417-443 (2015) 3) Langhorne, J., Ndungu, F. M., Sponaas, A. M. et al.: Immunity to malaria: more questions than answers. Nat. Immunol., 9, 725-732 (2008) 4) Butler, N. S., Harris, T. H. & Blader, I. J.: Regulation of immunopathogenesis during Plasmodium and Toxoplasma infections: more parallels than distinctions? Trends Parasitol., 29, 593-602 (2013) 5) Kimura, D., Miyakoda, M., Honma, K. et al.: Production of IFN-γ by CD4+ T cells in response to malaria antigens is IL-2 dependent. Int. Immunol., 22, 941-952 (2010) 6) Butler, N. S., Moebius, J., Pewe, L. L. et al.: Therapeutic blockade of PD-L1 and LAG-3 rapidly clears established blood-stage Plasmodium infection. Nat. Immunol., 13, 188-195 (2011) 7) Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T. et al.: Regulatory T cells and immune tolerance. Cell, 133, 775-787 (2008) 8) Collison, L. W., Chaturvedi, V., Henderson, A. L. et al.: IL-35-mediated induction of a potent regulatory T cell population. Nat. Immunol., 11, 1093-1101 (2010) 9) Xia, H., Ye, Z. J., Zhou, Q. et al.: IL-27 and IL-27-producing CD4+ T cells in human tuberculous pleural effusion. Tuberculosis, 94, 579-588 (2014) 〈著者プロフィール〉 木村 大輔（Daisuke Kimura） 略歴：長崎大学大学院医歯薬学総合研究科 助教． 研究テーマ：マラリア原虫の感染に対する免疫防御． 由井 克之（Katsuyuki Yui） 長崎大学大学院医歯薬学総合研究科 教授． 研究室URL：http://www.med.nagasaki-u.ac.jp/mmi/im/index.html 〈図説明〉 図1　Tr27細胞の分化の経路 ナイーブT細胞は，抗原による刺激ののち，Tr27細胞を含むさまざまな機能をもつ細胞へと分化する．